【摘  要】在先进的扩培系统中，如何控制最佳充氧量并减少酵母生长限制因素等问题将应得到解决。实验首先在10-hL扩培罐中进行，接着在100-hL和160-hL罐中进行。实验的目的主要是在使用一种新的充氧方式下减少对酵母生长的不利因素影响，从而找到扩培过程中的最佳充氧量。在最近的多数实验中，对160-hL扩培罐的排出气体进行检测，并将气体体积及其中的氧含量与细胞增殖的相关因素进行比对。令人兴奋的是，结果很具有指导意义——发现了一种简单而有效的控制方法。主要内容有，搅拌器的使用不会影响酵母增殖，高浓度的氧气的使用应被限制。另外，由于氧化还原势的影响要小于CO2含量的影响，因此充氧的作用要能够将扩培罐中的CO2含量降到一个较低的水平。通过检测扩培罐中排出气体的成分，可以判定有氧代谢作用的停止时间。一个测定这个的简单而有效的方法是对每度底产生的酵母细胞数（每毫升）进行计数。低的产量意味着有氧代谢作用的不足。另一种简单但并不太可靠的方法是观察泡沫情况。丰富的泡沫就意味着有大量麦汁产生了大量的CO2，而大量的底物浓度被消耗就意味着无氧代谢的开始。
【关键词】充氧作用  O2  扩培  生长限制因子  酵母  生产

酵母扩培——酿造获得纯种酵母的捷径
纯种酵母扩培作为酿造生产的一个重要组成部分，已经存在了100多年了。然而由于酵母本身的兼性特征，其扩培过程仍然具有许多未知因素。酿造酵母不会永远存活，在发酵一段时间后——大罐生产中少于10次，必须要用新生酵母来进行更替。与发酵过程相比较，酵母扩培有与酿造生产完全不同的培养特性。研究分析两种过程的差异性是一个有趣的课题。
在酿造生产中，我们总是期望所使用的酵母具有良好的发酵性能和快速的增殖能力，并且这些性能特点还能够在扩培过程中得到很好的保持。但问题是当酵母利用麦汁进行扩培时，总会受到代谢降解产物的反馈抑制作用，从而限制了酵母对氧的吸收利用。近年来的研究证明在扩培过程中总有一些因素对酵母的生长形成阻碍，并进而影响到酵母的活性甚至是啤酒的质量。这些阻碍因素在很大程度上是由于充氧方式的不同而引起的。
在酿造生产中，扩培总是在特定的反应容器中进行，并使用同一种底物——麦汁来生产啤酒。而在专门的酵母生产企业，扩培是在一种流式反应容器中进行——连续地供应低浓度底物，然后是强烈的充氧。100年前就已经为人所熟知的事实是，由于克拉勃垂效应（即葡萄糖效应）的存在，需要使用低浓度底物来克服生产中出现的一些负面影响。反馈抑制作用将极大地限制酵母在高浓度底物溶液中的有氧代谢作用，比如说在麦汁中，将很难增加生物量。然而在啤酒生产中又会默许这种影响因素的存在，因为如果单纯的优化不同底物浓度下酵母的增殖过程的话，就会危害到发酵过程，并进而降低啤酒质量。啤酒生产企业一般的做法是通过严格的卫生控制手段来避免杂菌的污染并减轻扩培过程中酵母生长的限制影响，进而减少发酵过程中负面因素的影响。
在先进的扩培系统中，如何通过优化充氧程序并同时降低扩培过程中对酵母增殖的影响程度的问题将会得到很好的解决。
酵母数据
产率与氧的吸收利用
如果将酵母生产厂家与酵母酿造企业的生产过程进行生物产量上的比较，可以发现其中的差异性是显著的。如表一所示，当采用供应低浓度的营养基质和维生素时，可得到54%的产率，即100克浸出物可以生产出54克的酵母干物质。这时需要74%的供氧量，即每克酵母干物质中吸收进了740毫克的氧。当酵母在12°P~16°P的浸出物浓度下的麦汁中进行扩培时，最终只能得到5~10%的产率，仅仅比纯无氧发酵的产率略高，而且氧的吸收利用量只有12%，即每克酵母干物质中只吸收了120毫克的氧。
表一：氧的吸收利用
 产率（克酵母干物质/克糖类） 氧利用量（毫克氧/克酵母干物质）
纯有氧作用 0.54 740
12°P麦汁扩培 0.1 120a
a， 相当于每小时中，每克酵母干物质约需求10~20毫克氧（受扩培温度影响）
空气供应
每克酵母干物质120毫克氧的摄入量不是一下子就吸收完毕的，而是分散于整个细胞生长周期中——通常叫做倍增时间，受温度影响较大，可从12℃时的12小时减少到20℃时的6小时。也就是说在麦汁扩培过程中，每小时内，酵母细胞能够摄入相当于每克酵母干物质10~20毫克氧的氧气量。举个例子，每升溶液中的1克酵母干物质相当于每毫升溶液中含有4.0×107个细胞，以这个接种量进行起酵，理论上讲，在5吨容量的发酵罐内，采用无菌空气进行充氧，则从5.0×107个/毫升的浓度增殖到1.0×108个/毫升时所需的空气量仅为100L——略少于2L/分钟。
酵母生长的不利因素
在解决了酵母扩培系统的卫生问题，并且意识到了在发酵状态下最大充氧量不是最佳充氧量的问题，我们的目标就转到降低酵母细胞生长的不利因素的影响方面。
就整个扩培过程考虑，影响酵母生长的不利因素包括：（1）机械剪切力（2）氧化还原势（3）CO2毒性（4）酒精毒性。
其中前三个方面与扩培罐的充氧搅拌有很大的关系，而第四个因素基本上在整个过程都发挥作用，时间相对较长。正如最大充氧量不是最佳充氧量一样，达到最大细胞数时的酵母也不是活性最强的酵母。在最近的研究中发现，酵母呈现最强活性时的细胞浓度在每毫升1.0×108个左右。
实验扩培罐的测试
在扩培系统中，为了找到最佳的充氧水平和最佳的酵母细胞浓度，进行各种各样的测试。
用于几个阶段测试实验的充氧搅拌装置由SCANDI BREW提供，是一种安装在扩培罐中心位置的中空杆状搅拌器。（如图1所示）最初的测试是在的10-hL扩培罐内进行的。
 
图1 SCANDI BREW 搅拌器
最初的测试解决了以下几个问题。
* 搅拌器是否能够给酵母提供足够的氧？
* 是否能够确定充入的氧是多了还是少了？
* 搅拌器是否会对酵母生长形成新的不利影响？
得到满意的答案后，第二步测试将在完全条件下进行，主要是建立一个最佳扩培过程的充氧模型，以确保在以后进行扩培测试中该模型不会给酵母带来任何不利影响。
实验扩培罐的测试结果
搅拌器是否能够给酵母提供足够的氧？
第一个问题是搅拌器是否能够为酵母提供足够的氧。在扩培罐上与取样口连接的位置安装一个含氧检测仪，通过检测扩培罐内液相氧的含量就可以解答这个问题了。
结果显示实验扩培罐安装的搅拌器所起的效果非常明显。实验中，搅拌速度在3m/s时DO值在2~6ppm，搅拌速度在1.7m/s时DO值则小于0.1ppm。
这说明在搅拌转速与DO值之间有非常明显的联系。而同期实验证明，不同的空气充入量对DO值的影响要小于搅拌器转速的改变对其的影响。3m/s转速下氧能够被良好的吸收的原因就在于快速的搅拌能够产生许多细小的气泡，从而可以形成一个巨大的接触表面。正是由于这个巨大的接触表面使得有更多的氧溶入到液体中。
扩培中高DO值与低DO值控制的差别是什么？
第二个问题是如何来证明高DO值对于酵母细胞数与生长限制因子的关系。与这个问题相关的两个有趣的参数是细胞的倍增时间，检测每毫升溶液中每消耗1°P底物所得到的细胞产率。
由于大家比较认同的观点是大型酵母的最佳细胞数是在1.0×108个左右，所以每次的测试就以这个数据值为扩培终点。但其中有两次扩培被允许超出该数值。
高DO值的扩培在倍增时间上与低DO值相同，产率则约高10%（如表2所示）。这就是问题是否值得为10%的产率而冒氧化还原势压的风险的缘由。在扩培中允许酵母继续增殖，直到细胞数超过1.2×108个/毫升而达到1.0×108个/毫升时，倍增时间增加了，产率也在后半段减低了，而且也证实在这个阶段酵母活性有变弱。
表2 倍增时间和产率与DO值和细胞数的关系
扩培测试a 倍增时间（小时） 产率（×106个细胞/毫升*°P底物）
高DO值（>2mg/L）（搅拌器转速3m/s） 7—7.9 29—40
低DO值（<0.1mg/L）（搅拌器转速1.7m/s） 6.4—8 26—36
超过1.2×108个/毫升 14.8—19.5 13—20
a. 10-hL扩培罐，温度控制14.5℃
搅拌器是否会造成对酵母的不利？
对酵母生长形成危害的反映指标的检查可以通过下列实验进行分析：（1）亚甲基蓝染色检测（2）吖啶橙染色检测（3）蛋白酶活性检测（4）中链脂肪酸含量检测（5）可滤性检测（6）CO2含量检测。
结果显示（如表3所示），在所有实验中没有任何可测指标可以反映对酵母生长造成了影响。但是在实验中可以检测到最大CO2含量为1克/升，与DO值之间呈反比例关系。1.7m/s的转速下CO2含量接近1克/升，而3m/s转速下CO2含量接近0。
表3 对酵母可能造成影响的检测
分析 结果
亚甲基蓝染色活性检测 死亡率<1%
吖啶橙染色活性检测 死亡率<1%
蛋白酶活性检测 无影响
中链脂肪酸含量检测 在浓度上与搅拌转速没有联系
可滤性检测 >4.5(具有良好可滤性能)
CO2含量检测 在所有测试中小于1克/升
全程测试
倍增时间与产率
全程实验分别在100-hL和160-hL扩培罐中进行。在100-hL和160-hL扩培罐中,实验的目的是看从10-hL扩培罐中得到的结果是否能够得到应用，继而建立一个充氧模式（如表4所示）。
表4  全程扩培实验结果
扩培过程 倍增时间(小时) 产率（×106个细胞/毫升*°P底物）
100-hL,15℃ 8.7 30
160-hL,16℃ 8-17 10-40
在100hL扩培罐内进行实验所得到的结果与在10hL中得到的结果非常近似。三次实验的进行和扩培系统的运行基本都按照10hL扩培罐内的实验参数进行控制。当酵母的细胞浓度达到所期望的1.0×108个/毫升时，扩培停止。
在160hL扩培罐中进行的实验得到了完全不同的结果，是由于我们只是想建立一个充氧模式，而不是只想每次都得到一个最佳结果。
在扩培过程中建立一个最佳充氧模式
160hL扩培罐中的测试是为了建立一个控制扩培过程的模式。首先就意味着对充氧的控制。一个很显著的办法就是在扩培罐上安装一根O2检测探针，然后对酵母的最适DO水平进行控制。但存在的一个现实问题是，在麦汁这种含有高浓度糖组分的溶液中，氧探针不能稳定可靠地工作。如果能准确地控制空气的供应量，就可以采用另一种解决办法。如图2所示，在SCANDI BREW 发酵罐上，安装一根氧探针和一个排放气体的流量计。在SCANDI BREW扩培罐中，空气通过搅拌器中的中空管充入，未被吸收的控制夹带着CO2从罐顶的限压阀中排出。排出的气体则在此位置进行取样检测。
 
图2 SCANDI BREW 发酵罐（FI=流量计，LS=液位检测器，
M=搅拌电机，PI=压力计，TT=温度感应器）
测试步骤
氧含量探针可以测到最大为21%浓度的氧含量值，即大气中的氧含量。但实际上检测出的数值远远低于该数值，其中一个原因是有一部分被酵母细胞所吸收利用了，另一个原因是被CO2所稀释了。为排放气体中检测到的含氧量设置一个固定值，当探针检测的含氧量低于设定值时，充氧就开始。
由于很难确定这个设定值，因此测试从比较低的2%、4%的含氧量水平开始进行。结果显示，在扩培过程中，氧的供应存在不足，细胞处于无氧代谢状态，产率低且倍增时间长。如此一来，当氧供应不足时，酵母细胞进入无氧代谢状态，大量的糖分被消耗，而大量的CO2被生成，进而导致产生大量的泡沫。值得注意的是，当酵母生长旺盛时，细胞处于有氧代谢状态，糖分的消耗水平很低，产泡情况也不强烈。与低设定值相反，将设定值定为15%，大幅度增加的充氧量只略微增加了好氧生长的周期，但产生的问题是，当酵母由有氧代谢状态转入无氧代谢状态时，会强烈起泡并将气体排放口处的探针污损。将设定值定为10%时，酵母能够维持有氧代谢状态，而且最大程度地解决了泡沫问题。近期实验表明，8%的设定值，能够使酵母保持最佳生长状态，并可以避免翻泡问题，因此将其定为参考值。
全程测试结果
合适的充氧水平对扩培过程非常重要（如表5所示）。供氧不足导致有氧代销作用受到限制，产率低，倍增时间延长和由于充入的空气中带有的CO2而产生的泡沫问题等等。
表5 充氧程度
充氧设定值（%氧含量）a 结果
2 供氧不足，倍增时间长，低产率
4 供氧不足，倍增时间长，低产率
15 有氧代谢周期延长，当酵母结束有氧代谢时泡沫多
10 有氧代谢周期延长，但酵母结束有氧代谢时泡沫要少于高设定值时
8 有氧代谢周期延长，泡沫情况在控制要求内
a.按测试目的进行
大量的充氧会导致有氧代谢作用时的生长周期拉长，在酵母由有氧代谢状态转入无氧代谢状态时产生大量泡沫。适合的充氧量能够提供与大量充氧差不多的细胞数、产率和倍增时间，但能够极大地减少在有氧代谢状态结束时产生的泡沫问题。由于排出气体量和泡沫生成量的显著增加，使得有氧代谢作用周期的结束时间可以很容易被检测到。
氧探针的设定值应尽可能地低——8%只是这些实验所确定的最佳设定值。然而，当由于产生的大量CO2导致氧含量供应不足时，应立即停止扩培。这时，泡沫也会开始增加。
讨论
充氧量在扩培过程中是一个很重要的控制参数。可以根据产率、倍增时间、气体生成量和泡沫情况等参数对充氧量进行控制。这些基本的参数数据如图3所示。进一步的研究工作将是使这些结果进行量化，并最终弄清楚对酵酵母特性的影响。
 
图3 酵母扩培的基本参数

译自《MBAA TQ》vol.42,no.2-2005